高复制性阿德福韦酯耐药/缺失变异HBV株的克隆及部分生物学特性分析

【摘要】世界上超过3.5亿的人口感染乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV),HBV感染仍然是全球的健康问题。慢性乙型肝炎病毒持续感染可能会演变为肝硬化和肝癌,每年死于HBV感染相关的肝衰竭、肝细胞癌达百万。故临床治疗仍然是很大的挑战。核苷(酸)类似物类抗病毒药物的出现及广泛应用,对长期抑制病毒、延缓疾病进展、减少并发症的发生起到了关键性的作用。该类药物主要作用于HBV的聚合酶RT区而发挥抗病毒作用,显著抑制HBV的复制、改善肝功能和组织学损伤。但要巩固疗效需长期维持治疗。长期治疗势必诱导乙肝病毒耐药株的产生,引起临床治疗失败。乙型肝炎病毒为逆转录病毒,逆转录过程中因逆转酶无校对功能,造成基因突变高发。在药物选择压力下,HBV耐药株更易成为优势株。因此,一旦临床治疗过程中出现病毒学突破等治疗失败的情况,均应进一步分析其耐药情况。体外表达质粒研究HBV复制特性及药物敏感性,对特殊耐药株的深入研究尤为重要,可将临床分离株的在体外得以真实表达,指导临床合理治疗、评价药物疗效。对临床耐药HBV毒株的研究需构建能反映感染者体内HBV株生物学功能的体外表达克隆。为此,我们开展了以下工作：第一部分构建含临床分离株HBV基因的体外表达质粒及基因序列分析目的：由临床发现的耐药患者血清构建含其HBV基因的体外复制质粒,进行序列分析。方法：将临床上一名接受拉米夫定、阿德福韦序贯治疗产生病毒学突破且HBV高载量的患者血清,抽提HBVDNA、RT区扩增。发现其具有阿德福韦酯相关耐药位点变异及S区缺失,进一步行HBV全基因扩增、HBV全长测序、序列分析及全基因克隆。以临床株HBV全基因克隆为基础将HBV全长连接至PHY106载体,构建含1.1倍HBV基因信息的体外复制质粒。同时应用相同载体(PHY106)构建含1.1倍野生型HBV的体外复制质粒作为参照,为随后的细胞实验做基础。结果：由患者血清抽提HBVDNA,行PCR全基因扩增,成功将该病毒株的HBV连至PUC19载体构建全基因克隆共6个。发现该例特殊变异株的6个克隆全部存在阿德福韦酯相关耐药位点rtA181T变异,4株联合rtN236T变异,且6克隆均在其PreS1区发现长达207bp的缺失,并且在S区均意外出现两个终止变异。将此6个HBV全基因克隆全部成功构建为含1.1拷贝HBV基因组的体外复制质粒以进一步研究其生物学特性。结论：由临床血清分离的HBV特殊变异株可成功构建用于体外研究的可复制质粒。第二部分高复制性乙肝病毒临床分离株的体外复制及表型耐药研究目的：研究临床特殊变异株的部分生物学特性。方法：将第一部分构建的HBV1.1倍体质粒转染肝癌细胞系(Huh7),细胞上清液中HBsAg及HBeAg的水平用ELISA法检测,了解其对HBsAg分泌的影响。采用Southernblot技术研究该特殊变异株较野生株的HBV复制水平,并应用临床常用核苷类抗病毒拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦、替诺福韦进行表型耐药试验,对该特株变异株部分生物学特性进行了研究。结果：Southernblot结果提示该特殊变异株复制能力较野生株明显增强。优势株的表型耐药分析结果提示：该特殊病毒株对阿德福韦酯敏感性显著下降,对拉米夫定、替诺福韦敏感性轻度下降,对恩替卡韦保持与野生株同样的敏感性。结论：HBV缺失及耐药变异可能导致HBV的复制能力增强。体外药物敏感性与患者发生血清学突破、治疗失败相符。
【作者】汪婷；
【导师】赵卫峰；张继明；
【作者基本信息】苏州大学，内科学，2014，硕士
【关键词】乙型肝炎病毒；缺失变异；阿德福韦酯耐药；rtN236rtA181变异；HBV复制；转染；表型耐药分析；

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